Isi
- tahap
- Metode 1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Gram
- Metode 2 dari 2: Lakukan Tes Noda Ziehl-Neelsen
- Metode 3 Pelajari perilaku dan penampilan bakteri
- Metode 4 Menafsirkan semua hasil
Identifikasi bakteri adalah tugas yang kompleks. Salah satu alasannya adalah bahwa, menurut perkiraan, ada antara 10.000 dan 1 miliar spesies bakteri di dunia! Bakteri pengidentifikasi yang tepat sangat penting, terutama di bidang medis, di mana pengobatan penyakit yang tepat sangat tergantung pada jenis mikroba yang menyebabkan masalah. Dalam kebanyakan kasus, identifikasi dilakukan atas dasar eliminasi. Untuk mengidentifikasi bakteri, Anda harus melakukan tes pewarnaan, menganalisis penampilannya dan mengamati bagaimana bakteri merespon dengan baik berbagai kondisi. Jika Anda membutuhkan hasil cepat, ambil sampel DNA untuk dikirim ke laboratorium.
tahap
Metode 1 Identifikasi bakteri dengan pewarnaan Gram
- menentukan jika bakteri Gram positif atau negatif. Pewarnaan gram adalah metode membagi bakteri antara dua jenis yang paling umum: Gram positif dan Gram negatif. Yang pertama memiliki dinding sel tebal yang terdiri dari polimer yang disebut peptidoglikan, yang memiliki pewarnaan terbaik sebagai dinding tipis bakteri Gram-negatif.
- Beberapa jenis bakteri Gram-positif yang umum adalah streptococci, staphylococci, micrococci (atau micrococci) dan listeria.
- Berikut adalah beberapa contoh umum bakteri Gram-negatif: Neisseria, Acinetobacter, Moraxella, Enterobacteriaceae, Vibrio, Haemophilus, Fusobacterium dan Campylobacter.
- Ambil tindakan perlindungan yang tepat. Bakteri dan unsur-unsur kimia yang akan Anda gunakan selama tes menimbulkan risiko bagi kesehatan Anda. Kenakan kacamata pengaman, sarung tangan nitril sekali pakai dan jas lab saat melakukan tes pewarnaan. Setelah selesai, masukkan sarung tangan dan semua bahan lain yang terkontaminasi ke dalam tas khusus. Ingatlah untuk mengikuti prosedur laboratorium Anda untuk menyingkirkan tas untuk produk yang terkontaminasi.
- Masukkan sampel untuk diamati pada slide kaca. Untuk memulai tes, letakkan setetes atau spesimen bakteri pada slide steril. Kemudian, geser pisau di atas pembakar Bunsen yang menyala tiga kali untuk memperbaiki sampel dan mencegahnya keluar dari piring ketika Anda membilas atau menambahkan reagen.
- Tambahkan 5 tetes kristal ungu ke pisau. Tuangkan lima tetes larutan kristal violet ke sampel. Tunggu sebentar hingga sampel menyerap kristal ungu.
- Pegang pisau pada tempatnya dengan jepitan pakaian agar Anda tidak menodai tangan.
- Cuci pisau secara menyeluruh untuk menghilangkan noda. Gunakan keran atau botol pemerasan dan biarkan air mengalir sangat lambat hingga lima detik untuk menghilangkan residu tinta yang belum melekat pada sampel.
- Tuang lima tetes Gram Diode Stain ke slide. Ini adalah solusi yang terdiri dari dioda, natrium bikarbonat, dan kalium diodida yang menyebabkan kristal violet meleleh dengan dinding sel bakteri. Tuangkan lima tetes larutan pada sampel dan biarkan selama satu menit.
- Cuci sampel dengan alkohol atau asam laktat. Alkohol dan lacetone adalah zat pemutih dan akan menghilangkan pewarnaan dinding sel bakteri jika mereka Gram-negatif. Tuangkan beberapa tetes pemutih ke sampel dan biarkan bekerja tidak lebih dari tiga detik. Setelah itu, coba bilas perlahan dengan air selama lima detik untuk menghilangkan zat pemutih ini.
- Jika Anda membiarkan pemutih bekerja untuk waktu yang lama, hal itu dapat mengakibatkan hilangnya pewarnaan bakteri Gram-positif, yang berakibat negatif palsu.
- Lakukan tes kontras dengan safranin. Safranin adalah pewarna merah yang kontras dengan kristal ungu, sehingga mewarnai bakteri yang tidak terpengaruh oleh pewarnaan ungu. Tuangkan sekitar lima tetes safranin ke dalam sampel dan biarkan selama satu menit. Setelah itu, coba bilas dengan lembut dengan air selama lima detik.
- Visualisasikan sampel Anda pada perbesaran 1000X. Bakteri akan menjadi ungu atau ungu jika Gram positif, atau merah muda jika Gram negatif karena safranin.
Metode 2 dari 2: Lakukan Tes Noda Ziehl-Neelsen
- Gunakan teknik ini untuk mendeteksi bakteri tahan asam. Spesies ini mengandung jumlah lipid yang lebih besar, membuatnya lebih tahan terhadap pewarna yang digunakan dalam pewarnaan Gram. Bakteri tahan asam milik genus Mycobacterium, yang termasuk bakteri yang bertanggung jawab untuk tuberkulosis (M. tuberculosis). Untuk mewarnai bakteri yang tahan asam, Anda harus menggunakan pewarna merah yang disebut carbolic fuchsin, tahan terhadap pembilasan dengan larutan asam asam atau sulfur.
- Ambil tindakan perlindungan yang tepat. Bahan kimia dan biologis yang digunakan selama pewarnaan Ziehl-Neelsen bisa berbahaya. Selain itu, Anda juga perlu menggunakan sumber panas, seperti nosel Bunsen, pemanas listrik atau lampu alkohol. Ikuti instruksi di bawah ini untuk melakukan tes.
- Kenakan kacamata, sarung tangan nitril dan jas lab.
- Berhati-hatilah untuk tidak menghirup uap dari pewarna dan pemutih dan jangan biarkan tetesan memerciki mata atau kulit Anda. Biarkan wadah terbuka di bawah tudung.
- Berhati-hatilah saat menghangatkan mata pisau. Sebagian besar bahan kimia yang digunakan mudah terbakar. Mungkin juga ada jejak zat yang mudah terbakar di slide atau peralatan lainnya.
- Siapkan bilahnya. Dengan gerakan memutar, sebarkan sampel bakteri dalam jumlah sedikit di tengah slide steril. Sampel Anda harus menempati sekitar 10 mm x 20 mm.
- Keringkan bilahnya. Tempatkan pisau pada struktur pengeringan dengan spesimen menghadap ke atas. Biarkan mengering secara alami selama 30 detik. Jangan mencoba mengeringkan mata pisau dengan kain.
- Amankan sampel dengan panas. Dengan spesimen ke atas, geser pisau dua atau tiga kali di atas pembakar Bunsen yang menyala. Anda juga dapat menempatkan blade pada pemanas listrik dengan mengatur suhu antara 65 ° C dan 75 ° C selama setidaknya dua jam. Berhati-hatilah untuk tidak merebus atau membakar sampel.
- Tambahkan caruchic fuchsin ke blade. Tuangkan beberapa tetes larutan ini pada slide. Tuang secukupnya hingga benar-benar menutupi sampel.
- Panaskan pisau untuk memperbaiki pewarna. Hangatkan slide dengan hati-hati di atas pembakar Bunsen atau lampu alkohol, dengan sampel diarahkan ke atas, atau letakkan di atas pemanas listrik. Panaskan pisau hingga 60 ° C atau sampai mulai melepaskan uap. Biarkan pewarna bekerja selama lima menit.
- Jika Anda menggunakan pemanas listrik, nyalakan pada suhu 60 ° C. Jika Anda memilih lampu alkohol atau pembakar Bunsen, Anda akan melihat asap.
- Untuk menjaga pisau pada suhu yang diinginkan selama lima menit, hangatkan sebentar-sebentar.
- Berhati-hatilah untuk tidak merebus, membakar, atau mengeringkan sampel.
- Bilas pisau dengan air dingin. Biarkan dingin selama lima menit dan bilas perlahan selama beberapa detik dengan air jernih. Gunakan air keran atau botol pemerasan untuk menghilangkan noda pewarna yang belum melekat pada sampel.
- Tuang sampel alkohol asam atau asam sulfat. Gunakan volume 3% volume (v / v) alkohol atau 20% asam sulfat untuk sepenuhnya menutupi sampel. Biarkan asam bekerja sampai warnanya memudar dan mencapai warna merah muda yang sangat cerah. Prosesnya biasanya memakan waktu sekitar sepuluh menit.
- Gunakan air bersih untuk membilas bilah. Cuci pisau dengan lembut di bawah keran atau menggunakan botol pemerasan. Buang semua residu asam dan pewarna dengan baik.
- Tambahkan agen kontras. Setelah membilas slide, tuangkan pewarna hijau perunggu atau biru metilen. Dua solusi ini menciptakan latar belakang kebiruan atau kehijauan di mana pewarna merah akan muncul, serta bahan biologis lainnya, seperti sel manusia dan bakteri tahan asam. Biarkan zat bekerja selama satu hingga dua menit.
- Bilas dan keringkan bilahnya. Bilas bersih dengan air untuk menghilangkan kontras berlebih. Setelah selesai, keringkan bagian belakang bilah dengan kain kering dan biarkan mengering secara alami di atas dudukan.
- Visualisasikan sampel Anda pada perbesaran 1000X. Bakteri yang tahan asam akan berubah menjadi merah atau merah muda gelap. Bakteri lain, sel non-bakteri dan pangkal pisau akan berubah menjadi hijau atau biru.
Metode 3 Pelajari perilaku dan penampilan bakteri
- Menganalisis bentuk bakteri. Setelah melakukan tes pewarnaan untuk menentukan apakah bakteri itu Gram-positif, Gram-negatif atau tahan asam, sekarang saatnya untuk mengidentifikasi spesies lebih tepat. Pertama, analisis bentuk bakteri pada slide. Tiga bentuk yang paling umum adalah cocci (bola), spiral dan basil (bentuk batang).
- Ada beberapa varian bentuk ini. Bakteri berbentuk bulat (coccus), misalnya, dapat muncul berpasangan (diplococci), dalam rantai, dalam tumpukan atau dalam kelompok empat (tetrads).
- Cari tahu apakah bakteri itu aerob atau anaerob. Ambil dua sampel bakteri dan buat dua kultur terpisah. Bulan harus anaerob (tumbuh tanpa oksigen), sedangkan yang lain harus aerob (tumbuh dengan oksigen). Simpan biakan anaerob pada suhu 35 ° C di tempat bebas oksigen selama setidaknya 48 jam sebelum mengamati pertumbuhan.
- Jika bakteri tumbuh di lingkungan tanpa oksigen, tetapi tidak ketika terpapar oksigen, itu berarti mereka bersifat anaerob.
- Meskipun mereka berkembang di lingkungan yang teroksigenasi, tetapi tidak dengan tidak adanya oksigen, mereka aerobik.
- Ketika mereka berkembang di kedua lingkungan, kita berbicara tentang bakteri anaerob fakultatif.
- Lakukan tes motilitas. Bakteri bergerak jika dapat bergerak sendiri dengan satu atau lebih flagela. Tingkat motilitas sangat penting dalam identifikasi spesies bakteri tertentu. Ada beberapa jenis motilitas, tetapi cara teraman dan terbaca adalah media semi-padat.
- Buat budaya untuk tes motilitas. Siapkan kultur bakteri dalam kaldu kultur. Ikuti instruksi di bawah ini untuk menyiapkan kaldu pilihan Anda.
- Suntikkan kultur dalam agar semi-padat untuk tes motilitas. Lapisi sebagian kultur kaldu dengan jarum inokulasi steril. Masukkan jarum dengan hati-hati ke dalam tabung dagar semi-padat, seperti TTC lagar, yang telah Anda siapkan untuk pengujian. Jarum harus menembus 2/3 agar-agar.
- Setelah selesai, lepaskan jarum dengan hati-hati, berhati-hatilah agar tidak melebihi batas zona inokulasi.
- Inkubasikan tabung pada suhu 30 ° C selama 48 jam.
- Baca hasil tes. Agar untuk tes motilitas akan berubah menjadi merah saat bersentuhan dengan bakteri. Jika mereka bergerak, semburat merah atau merah muda ini akan menyebar ke seluruh substansi. Jika tidak, pewarnaan akan terbatas pada tempat injeksi.
Metode 4 Menafsirkan semua hasil
- Kumpulkan komentar Anda. Untuk mengetahui jenis bakteri, Anda perlu mengumpulkan informasi yang diperoleh dari kultur, tes pewarnaan dan pengamatan bentuk. Jika Anda memeriksa sampel pasien, gejala yang ada juga dapat membantu menentukan jenis bakteri yang sesuai.
- Misalnya, jika tes menunjukkan bahwa bakteri itu gram-negatif, anaerob, tidak-motil dan Anda melihat gejala-gejala seperti sakit perut, mual dan muntah pada pasien, kemungkinan pasien menderita infeksi Bacteroides. fragilis.
- Konsultasikan dengan basis data. Ada ribuan spesies bakteri di dunia. Tidak mungkin untuk mengetahui semuanya dengan hati. Anda mungkin perlu membaca buku mikrobiologi klinis atau database online untuk membandingkan hasil tes dengan informasi tentang spesies bakteri.
- Ada sumber daya online yang sangat baik untuk mengidentifikasi bakteri, tetapi sebagian besar database ini tersedia dalam bahasa Inggris, termasuk Patricbrc.org dan GlobalRPh. Namun, Anda masih dapat menemukan informasi yang berguna di situs web Pusat Sumber Daya Mikroba Internasional INRA.
- Lakukan tes genetik untuk mengetahui spesies bakteri yang tepat. Dalam beberapa kasus, Anda mungkin perlu mengidentifikasi spesies bakteri. Metode tercepat dan termudah adalah melakukan tes DNA. Tes DNA juga berguna untuk mengidentifikasi bakteri yang kebal terhadap pewarnaan dan kultur tradisional. Saat ini, tes DNA pada mikroorganisme sangat cepat dan dapat siap dalam waktu kurang dari dua jam.
- Jika Anda tidak memiliki akses ke laboratorium yang melakukan pengurutan genetik mikroorganisme, kirim sampel bakteri ke agen khusus.